Importancia de la enfermedad
La psorosis es una de las enfermedades de los cítricos más antiguas, ya que fue la primera virosis de cítricos descubierta (fines de Siglo IXX). Es una enfermedad causada por un virus de la familia Ophioviridae, denominado Citrus Psorosis Virus (CPsV). Es una enfermedad transmisible principalmente por tejido vegetal, es decir, cuando se realizan los injertos. Por tal motivo, años atrás la psorosis se transformó en una epidemia difundida principalmente por el uso de yemas infectadas y fue una de las principales causas de pérdidas económicas directas e indirectas del cultivo de los cítricos en nuestra región. A la fecha ya no es muy frecuente encontrar plantas con psorosis en las quintas, lo cual en gran parte se debe a que desde hace más de 20 años se está aplicando en Argentina un Programa Nacional de Certificación (Res. 149/98 ex SAGPyA), el cual fue un producto derivado del objetivo que perseguía el proyecto PROCITRUS del INTA (Programa de Mejoramiento Varietal y Sanitario en Citrus desde 1994 hasta el 2000), que buscaba obtener, mantener y distribuir material cítrico (de copa y pie) libre de enfermedades y de alto valor horticultural. Sin embargo, los árboles aislados con psorosis que aún hoy se pueden encontrar en regiones donde se viene aplicando el Programa de Certificación pueden significar la evidencia de otra clase de transmisión de la enfermedad, aparte de las yemas, posiblemente algún insecto vector. En apoyo a esta evidencia, en Argentina desde el año 1965 hasta el 2013 varios investigadores realizaron estudios epidemiológicos que sugieren que la enfermedad se transmite naturalmente, de árbol a árbol, y si bien hasta el momento no se ha logrado determinar específicamente el vector asociado; podría tratarse de alguna especie de pulgón (Pujol & Beñatena, 1965; Beñatena & Portillo, 1984; Danós, 1990; Costa et al., 2013). Aunque hoy en día la enfermedad no es importante frente a otras que la citricultura enfrenta, como el HLB, como no se ha erradicado en nuestro país, continúa estando dentro de los diagnósticos obligatorios que se deben realizar a las Plantas Madres Originales proveedoras de yemas y/o semillas en el marco del mencionado Programa de Certificación.
Rango de hospedantes, sintomatología y diagnóstico de campo
Todas las especies de los géneros Citrus y Poncirus son susceptibles, como así también sus híbridos, muy utilizados como portainjertos. Las especies más susceptibles son la naranja dulce (Citrus sinensis), el limón rugoso (Citrus jambhiri), la mandarina (Citrus reticulata), y el pomelo (Citrus paradisi); mientras que otras especies como el naranjo agrio (Citrus aurantium), el limón (Citrus limon) y la toronja (Citrus grandis) pueden presentar síntomas, pero menos intensos. A campo el desarrollo de la enfermedad es lento, ya que el período entre la infección y la aparición de síntomas es de 10 a 15 años. La sintomatología característica de la enfermedad consiste en el descascarado del tronco principal y ramas, e incluso ramas delgadas y jóvenes; producción de manchas gomosas en hojas adultas y síntomas foliares como flecos cloróticos y manchas en brotes jóvenes, que suelen desaparecer al madurar las hojas. En estados avanzados de la enfermedad, se acumula goma debajo del descascarado de las ramas y tronco, que impregna la madera y obstruye los vasos de conducción de agua, lo que provoca reducción del rendimiento, muerte de ramas y finalmente del árbol (Roistacher, 1991; De Francesco, 2015).
Diagnóstico biológico
El diagnóstico de psorosis utilizando la metodología de plantas indicadoras o indexing fue el primer método desarrollado y aún tiene vigencia a nivel mundial. Esta prueba consiste en forzar la manifestación de síntomas foliares experimentalmente, para ello se inocula por injerto trozos de corteza de la planta a diagnosticar sobre plantines indicadores sanos, que luego son podados para forzar la brotación y se mantienen en invernadero en condiciones controladas. Cabe destacar que para la expresión de estos síntomas en los indicadores es fundamental el desarrollo de la prueba en un rango de temperatura adecuado para CPsV (18-24°C), ya que en condiciones no favorables puede disminuir la intensidad de los síntomas en las hojas o bien desaparecer (Roistacher, 1991). Las plantas indicadoras son variedades de cítricos muy susceptibles a la manifestación de síntomas para una enfermedad en particular, siempre que la prueba se desarrolle bajo las condiciones ambientales adecuadas para la multiplicación del agente causal a diagnosticar. Para psorosis las plantas indicadoras más comúnmente utilizadas son naranjo dulce de las variedades Pineapple, Olivelands o Madame Vinous (Roistacher, 1991). Con el indexing se pueden observar síntomas asociados a dos tipos de psorosis, A (PsA) o B (PsB). A campo la PsA se caracteriza por la lenta descamación de la corteza del tronco y ramas principales, mientras que la PsB produce esta descamación más rápido, incluso en ramas delgadas. En los plantines indicadores, el shock o necrosis del brote en la primera brotación, flecos cloróticos o flecking, manchas y anillado foliar en hojas de brotes jóvenes a muy jóvenes son síntomas vinculados a PsA; mientras que la aparición de pústulas de goma en hoja y corteza son síntomas característicos de PsB.
Para realizar indexing se requiere de habilidad técnica para la preparación de las plantas indicadoras y su inoculación y entrenamiento en reconocimiento de los síntomas, siendo además un método de diagnóstico lento (10 a 12 meses) y muy costoso. A pesar de ello, hasta el día de hoy sigue siendo el único método de diagnóstico aceptado por el INASE en Argentina, como organismo fiscalizador del Programa Nacional de Certificación, para efectuar diagnósticos de psorosis en Plantas Madres Yemeras y Semilleras (Anexo I Res. 149/98 ex SAGPyA, Anexo IV Res. 98/03 y sus modificatorias y Res. 302/2014 INASE).
Diagnóstico serológico
Por la necesidad de disponer de métodos de diagnóstico más rápidos que el diagnóstico biológico para la detección de psorosis y a medida que fueron avanzando los estudios de caracterización sobre CPsV, diferentes grupos de investigadores fueron desarrollando métodos inmunológicos para el diagnóstico de la enfermedad, dentro de los que se podría mencionar: DASELISA (García et al., 1997), TAS-ELISA (Alioto et al., 1999), TAS-ELISA-HRP (Zanek et al., 2006). La prueba de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) consiste en detectar pequeñas partículas llamadas antígenos, que son específicas de los organismos (en este caso de CPsV) y para ello utiliza dos moléculas, una que se llama anticuerpo que se une específicamente con el antígeno y una enzima que se activa y señala si hay unión entre anticuerpo y antígeno, lo que nos indicaría una detección positiva. El empleo del protocolo TAS-ELISA ha mostrado efectividad en la detección de aislamientos de psorosis de diferentes regiones citrícolas del mundo, siendo alta la correlación con los resultados obtenidos en el diagnóstico de estos aislamientos por indexing biológico (método de referencia)(Alioto et al., 1999). La detección de CPsV por este método se realiza en 48 horas, y desde el año 2004 para Argentina se incluyó esta metodología para el diagnóstico de esta enfermedad en el marco del Programa Nacional de Certificación sólo cuando se disponga de los anticuerpos y para retesteados de Plantas Madres Yemeras y/o Semilleras (Anexo I Res. 811/04 INASE)
Diagnóstico serológico
Por la necesidad de disponer de métodos de diagnóstico más rápidos que el diagnóstico biológico para la detección de psorosis y a medida que fueron avanzando los estudios de caracterización sobre CPsV, diferentes grupos de investigadores fueron desarrollando métodos inmunológicos para el diagnóstico de la enfermedad, dentro de los que se podría mencionar: DASELISA (García et al., 1997), TAS-ELISA (Alioto et al., 1999), TAS-ELISA-HRP (Zanek et al., 2006). La prueba de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) consiste en detectar pequeñas partículas llamadas antígenos, que son específicas de los organismos (en este caso de CPsV) y para ello utiliza dos moléculas, una que se llama anticuerpo que se une específicamente con el antígeno y una enzima que se activa y señala si hay unión entre anticuerpo y antígeno, lo que nos indicaría una detección positiva. El empleo del protocolo TAS-ELISA ha mostrado efectividad en la detección de aislamientos de psorosis de diferentes regiones citrícolas del mundo, siendo alta la correlación con los resultados obtenidos en el diagnóstico de estos aislamientos por indexing biológico (método de referencia )(Alioto et al., 1999). La detección de CPsV por este método se realiza en 48 horas, y desde el año 2004 para Argentina se incluyó esta metodología para el diagnóstico de esta enfermedad en el marco del Programa Nacional de Certificación sólo cuando se disponga de los anticuerpos y para retesteados de Plantas Madres Yemeras y/o Semilleras (Anexo I Res. 811/04 INASE)
Diagnóstico molecular
Los métodos moleculares para el diagnóstico de CPsV se basan en la detección de sus ácidos ribonucleicos (ARN). Desde el año 1997 diferentes grupos de investigadores comenzaron a diseñar cebadores o primers para la detección de CPsV por PCR (García et al., 1997; Barthe et al., 1998; Legarreta et al., 2000; Martín et al., 2002). Recientemente, se ha desarrollado un protocolo de RT-qPCR para detectar un fragmento de la proteína de cubierta de CPsV, codificada en el RNA 3 de su genoma (De Francesco, 2015). De acuerdo a los resultados obtenidos por De Francesco (2015), la RT-qPCR con los primers desarrollados para su protocolo mostró ser específica para la detección de CPsV, incluso en muestras de campo que presentaban infecciones mixtas como tristeza/psorosis y cancrosis/psorosis. Además, destaca que la sensibilidad en la detección de CPsV con este nuevo método es superior a la de TAS-ELISA, y demostró que en muestras de campo fue posible diagnosticar psorosis en plantas asintomáticas; debido a que con esta técnica es posible detectar concentraciones del virus en estadíos tempranos de la infección (recordar que el período entre la nfección y la aparición de síntomas a campo puede ser de 10 a 15 años), probablemente en baja concentración. Al presente en Argentina, esta metodología aún no se encuentra validada para el diagnóstico de psorosis, para ello en primer lugar es necesario realizar un número de muestras estadísticamente significativo comparando los resultados de este método con el test biológico. Desde el 2016 estos estudios se comenzaron a realizar en conjunto entre el equipo de trabajo del Instituto de Biotecnología y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata y el Laboratorio de Protección Vegetal y Biotecnología de la EEA del INTA Concordia, y los resultados preliminares de los análisis de más de 200 muestras de diferentes especies de cítricos y procedencias mostraron un 98,23% de coincidencia de los resultados entre ambos métodos, lo que deja abierta la perspectiva de que esta nueva metodología podría llegar algún día a incluirse en la normativa del Programa Nacional de Certificación de Argentina como un método válido para el diagnóstico de psorosis luego de analizar un mayor número de muestras (Simeone et al., 2019). Finalmente, se debe tener presente que si bien las técnicas de diagnóstico molecular de virus son más precisas y rápidas que los diagnósticos biológicos (duración de RT-qPCR: máximo 48 horas), su objetivo no debería ser el reemplazo de los últimos, ya que los métodos biológicos son un complemento indispensable para los diagnósticos moleculares debido a que los primeros son muy específicos; mientras que los últimos permiten manifestar síntomas de un rango más amplio de enfermedades. Se debe propiciar el aumento de la cantidad de herramientas de diagnóstico disponibles para el Programa Nacional de Certificación, y su uso debe ser complementario, lo que permitirá una mayor precisión en el diagnóstico.
Fuente: INTA por Claudio Andrés Gomez
