Las semillas verdes de soja son el resultado de un desequilibrio fisiológico producido durante la maduración del cultivo, asociado a condiciones de estrés termo-hídrico. El contenido de semillas verdes de un lote depende de la intensidad del estrés, del momento de ocurrencia y de la susceptibilidad del cultivar. Las semillas verdes presentan retención de pigmentos clorofílicos que podrían conducir a la reducción de la viabilidad, del vigor y de la germinación de los lotes de soja. Los objetivos del presente trabajo fueron: I) Analizar la viabilidad y el vigor de semillas verdes de soja y II) Estudiar la germinación de semillas, embriones y ejes embrionarios provenientes de semillas verdes.
Se utilizaron lotes de semillas de tres cultivares comerciales que maduraron bajo condiciones de estrés hídrico y térmico, y se obtuvieron los porcentajes de semillas verdes. Los porcentajes de viabilidad y de vigor se determinaron mediante la Prueba Topográfica por Tetrazolio sobre semillas maduras y semillas verdes de cada material. El Porcentaje de Germinación de semillas, embriones y ejes embrionarios provenientes de semillas maduras y semillas verdes se realizó en placas de Petri. Como indicador de velocidad se utilizó el tiempo que demoraron para alcanzar el 50% de la germinación. Los cultivares presentaron diferencias en la susceptibilidad a presentar semilla verde y en el impacto sobre su calidad fisiológica, pese a que maduraron bajo similares condiciones de estrés termo-hídrico. La condición verde tuvo un impacto negativo pronunciado sobre la germinación a nivel de semilla completa, siendo el tegumento una posible restricción adicional a la germinación.
La producción de simientes y su calidad fisiológica son el resultado de la interacción de factores bióticos y abióticos que inciden durante el desarrollo y la maduración del cultivo (Tekroni, 1980; Salinas, 2008). La calidad fisiológica de semillas es el grado de excelencia en atributos que determinan su comportamiento como simiente, tales como son la viabilidad, la germinación, el vigor y la sanidad (Hampton, 2002).
Cuando el cultivo alcanza R6 (Fehr y Caviness, 1977) la semilla de soja contiene una elevada concentración de clorofila y, entre R6 y la madurez fisiológica (R8), los pigmentos clorofílicos se degradan por la actividad de las enzimas clorofilasas, cambiando su coloración de verde a amarillo (Sinnecker, 2002; Cencig, 2013). Una semilla completamente amarilla es considerada como fisiológicamente madura (Tekrony et al., 1979). Sin embargo, condiciones de estrés termo-hídrico durante la maduración del cultivo pueden causar muerte prematura de plantas, maduración forzada de semillas y alteraciones en la actividad de las enzimas clorofilasas, resultando en la persistencia de pigmentos clorofílicos en las semillas (Bohner, 2003).
El genotipo y las condiciones climáticas son los factores que determinan la aparición de las semillas verdes (McGregor, 1991). Los cultivares de soja presentan diferente susceptibilidad a la retención de clorofila en semillas bajo condiciones de estrés hídrico y térmico durante la maduración (Pádua, 2006). La intensidad del estrés, el momento de ocurrencia y la susceptibilidad del cultivar determinan la intensidad de la retención de pigmentos clorofílicos (FrançaNeto et al., 2005).
La presencia de semillas verdes representa un factor negativo sobre la calidad fisiológica de los lotes de semillas de soja. Padua et al. (2007) concluyeron que existen reducciones lineales en la viabilidad, la germinación y el vigor a medida que se incrementa el contenido de semilla verde de lotes de soja. Craviotto et al, (2006) determinaron que las semillas verdes, independientemente de las alteraciones físicas como arrugas y abolladuras, manifiestan bajos niveles de viabilidad, germinación y vigor.
Craviotto y Arango (2001) identificaron dos tipos de semillas verdes: semillas totalmente verdes (coloración verdosa completa a nivel de tegumento y cotiledones) y semillas con tinte verdoso (tonalidad verde difusa sólo en cotiledones). La permanencia de los pigmentos clorofílicos indica que los tejidos están inmaduros y presentarían dificultades en la germinación e implantación. Los autores mencionaron que, si el embrión alcanza su madurez fisiológica, entonces existirían posibilidades de que germine, independientemente de que los cotiledones estén inmaduros.
Las semillas verdes presentan retención de pigmentos clorofílicos que podrían conducir a la reducción de la viabilidad y del vigor de los lotes de soja. La presencia de pigmentos clorofílicos en tejidos seminales como tegumentos, cotiledones y ejes embrionarios podría incidir sobre la capacidad germinativa de las semillas verdes.
Materiales y métodos
El trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Fisiología Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) y en el Laboratorio de Semillas de la Estación Experimental Agropecuaria Oliveros, del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Se utilizaron lotes de semillas de soja (Glycine max L.) de los cultivares SRM 3410 (cv1), SP 4×4 (cv2) y DM 4214 STS (cv3), sembrados el 23 de octubre de 2017 en la EEA Oliveros, provincia de Santa Fe. Entre los estadios R5 y R7, predominaron condiciones de estrés hídrico y térmico, predisponiendo a la aparición de lotes con diferentes grados de retención de pigmentos clorofílicos.
Porcentaje de semilla verde
El porcentaje de semillas verdes (%SVT) de cada cultivar se determinó a partir de una muestra de 100g de semillas. La determinación se realizó en forma manual y se consideraron dos categorías de semillas verdes, semillas con tonalidades verdosas parciales (Vp) y semillas con coloración verdosa total (V) (Figura 3). El %SVT se calculó sumando las dos categorías Vp y V (Figura 1). Esta categorización se utilizó como indicador de la susceptibilidad en la retención de pigmentos clorofílicos del material experimental ante condiciones de estrés.
Prueba Topográfica por Tetrazolio para evaluar Viabilidad y Vigor
De cada lote se extrajeron semillas con coloración verdosa total (V) y maduras (M), y se analizaron mediante la prueba Prueba Topográfica por Tetrazolio (PTTz) para evaluar Viabilidad y Vigor. La PTTz es una prueba bioquímica que permite determinar viabilidad y vigor utilizando una solución incolora de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio. Esta solución revela los procesos de reducción que ocurren durante la respiración en células vivas (ISTA, 2019). Las áreas vivas de las semillas se tiñen de color rosado-rojizo, distinguiéndose de las muertas que permanecen sin tinciones. La evaluación de la tinción en cuanto a ubicación, el color y la intensidad permite la identificación de las semillas de acuerdo con su viabilidad y vigor (Craviotto et. al., 2008). Se utilizaron 4 repeticiones de 50 semillas V y M de cada cultivar. Para el pre-acondicionamiento, las semillas se hidrataron en rollos de papel humedecido durante 18 horas a 20 °C. Para realizar la tinción, se colocaron las semillas en la solución de Tetrazolio a una concentración de 0.1% y se incubaron en baños termostáticos a 35°C de temperatura durante 2,5 horas. Después del período de tinción, las semillas se lavaron con agua corriente. Para la evaluación se consideraron las indicaciones de las Reglas ISTA (ISTA, 2018) y el Manual de la Prueba Topográfica por Tetrazolio en Soja (Craviotto et. al., 2008).
Los resultados se expresaron como porcentaje de Viabilidad (%Vi) y Vigor (%Vg).
Prueba de Germinación
Se estudió la germinación de semillas completas (S), embriones (E) y ejes embrionarios (J) provenientes de la condición V y M. Para ello, se incubaron en placas de Petri en agua destilada a 24 ± 1 °C y en oscuridad. Se analizaron tres réplicas de 10 muestras para cada condición. Se midió el porcentaje de germinación (%G) de S y E hasta las 184h de incubación y 170h para J. Se consideró como semilla germinada aquella que evidenció protrusión de la radícula a través del tegumento. En tanto, se consideró a E y J germinados cuando se alcanzaron un alargamiento de la radícula superior a los 5 mm de longitud (Gosparini et al., 2007). Como estimador de velocidad de germinación se utilizó el tiempo necesario para alcanzar el 50 %G (tG50).
Para el análisis estadístico, los resultados expresados en porcentajes se transformaron usando el arco seno de la raíz cuadrada de la proporción (arc sen √x/100). Los datos obtenidos en cada prueba se sometieron al análisis de varianza utilizando la prueba F y las medias se compararon mediante el método LSD de Fisher, con un nivel de significación del 0.05. Se utilizó el software estadístico InfoStat (Di Rienzo et al., 2017).
Resultados y discusión
Los datos meteorológicos de temperaturas máximas, medias y mínimas y los balances hídricos diarios de la EEA Oliveros durante la campaña 2017/18, indicaron que existieron condiciones de estrés térmico e hídrico durante el período R5-R7 para producir semillas verdes en los materiales analizados. El período de llenado de los tres cultivares se ubicó entre los meses de enero y febrero, donde existió un marcado estrés hídrico (Figura 2) y las temperaturas medias máximas superaron los 30ºC, siendo de 32,6 ºC para el mes de enero y de 34,2ºC para febrero (Figura 3).
Se observaron diferencias en cuanto a la susceptibilidad de los cultivares a presentar semillas verdes ante similares condiciones de estrés termo-hídrico, coincidente con lo mencionado por Pádua (2009). En la Tabla 1, se observa el %SVT alcanzado por los lotes de semillas de los cultivares cv1, cv2 y cv3, siendo los valores alcanzados de 44.81 %, 21.47 % y 31.92 %, respectivamente. El cv1 alcanzó el mayor %SVT, pero fue similar al cv3 en cuanto a %V.
Los porcentajes de viabilidad (%Vi) y vigor (%Vg) mostraron diferencias en la calidad fisiológica entre los cultivares; sin embargo, no se obtuvieron diferencias entre las SV y SM en cv1 y cv2. El cv3 presentó los menores %Vi y %Vg y se evidenció una caída marcada en la condición V con respecto a M (Tabla 1). En el cv3, que tuvo los mayores niveles de daño, se observaron semillas verdes sin tinción, que podrían demostrar fallas en el sistema enzimático respiratorio para la reducción de la sal de tetrazolio (Craviotto et al., 2006; Gallo et al., 2012). En coincidencia con los resultados obtenido por Gallo et al., (2012), se observaron ejes embrionarios con distintos niveles de deterioro o muertos y cotiledones con coloración verdosa (Figura 4).
No hubo diferencias significativas en %G de las semillas entre cultivares, pero sí se registraron diferencias estadísticamente significativas entre la condición V y M. El %G de SM y SV fue de 77 y 30 % para el cv1, 97 y 30 % para el cv2 y 97 y 33 % para el cv3. El tG50 de las SM fue de 39 h, 28 h y 31 h para cv1, 2 y 3, respectivamente. Sin embargo, las SV de los 3 cv no lograron alcanzar el 50% de G durante el experimento (Tabla 2). La germinación y la tasa de germinación de los embriones indicaron acentuadas diferencias entre M y V y entre cultivares (Tabla 2) (Figura 5). En cuanto a la tasa de germinación, las diferencias fueron más marcadas en la condición V, siendo el tG50 de los EM y EV en el cv1 de 13h y 58h, el cv2 de 18h y 32h y en el cv3 de 21h y 39h.
En los cultivares analizados, no se observaron coloraciones verdosas a nivel de ejes embrionarios, lo cual podría indicar que, visualmente, alcanzaron la madurez fisiológica. El %G y tG50 de los JM presentaron un comportamiento similar en los cv analizados; sin embargo, hubo diferencias en cuanto al %G de los JV, siendo para el cv1 de 67%, para el cv2 100% y para el cv3 83% (Figura 5). No se observaron diferencias en cuanto a la tasa de germinación de los JV y JM entre los cultivares (Tabla 2).
Los resultados mostraron que, para cada condición, las S presentaron menores %G y tasas de G respecto a E y J, con retrasos más evidentes para la condición V. Entre E y J el comportamiento fue similar en cuanto al %G. En la tasa de germinación no se observaron diferencias entre JV y JM, pero las diferencias fueron más acentuadas entre EV y EM.
Conclusiones
Los resultados indicaron que ante similares condiciones de estrés termo-hídrico, los cultivares presentaron diferencias en la susceptibilidad a presentar semilla verde y en el impacto sobre su viabilidad, germinación y vigor. La diferencia en la viabilidad y en el vigor de las SV y SM sólo se hizo evidente en el cultivar DM 4214 STS que alcanzó los mayores niveles de deterioro. La condición de verde tuvo un impacto negativo pronunciado sobre la germinación a nivel de semilla completa, siendo el tegumento una posible restricción adicional a la germinación.
Fuente: INTA por Mailen Ariela Martinez, Montechiarini N., Gosparini C., Miriam Raquel Arango, Carina del Valle Gallo, Roque Mario Craviotto.
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